[FR] Contact  Over deze website

BELGIAN BIOSAFETY SERVER

[Home Page] [Vorig Menu] [Zoek]

Ingeperkt gebruik van GGO's en pathogenen
Risico's gekoppeld aan het gebruik van virale vectoren, inserten of celculturen
(Laatste herziening: 4 juni 2004)

(onverminderd de eventuele bepalingen in toepassing in de besluiten betreffende het ingeperkt gebruik van GGO's en pathogenen in het Vlaams Gewest, in het Brussels Hoofdstedelijke Gewest en in het Waals Gewest)

• Virale vectoren
  • Algemene beginselen inzake indeling
  • Specifieke gevallen
    • Deficiënte adenovirale vectoren afgeleid van menselijke adenovirussen van het serotype 2 of 5
    • Deficiënte vectoren afgeleid van het muriene leukemia virus (MLV)
    • Deficiënte vectoren afgeleid van lentivirussen (HIV-1)
    • Propagerende vectoren afgeleid van poxvirussen (vaccinia en canarypox ALVAC)
    • Vectoren afgeleid van afhankelijke (AAV-2) en autonome (MVM en H-1) parvovirussen
• Versterking van het risico dat afhangt van de aard van het insert
• Celculturen
  • Primaire celculturen
  • Cultuur van cellijnen

A. Virale vectoren

1. Algemene beginselen inzake indeling

Virale vectoren zijn virale partikels die in vergelijking met de virale stam waarvan de vector is afgeleid, een artificieel gemodificeerd genoom dragen.
De pathogeniciteit van vele gebruikte oudervirussen, de instabiliteit van de virale genomen en de mogelijke recombinaties met andere virussen of met andere sequenties van cellulaire oorsprong verplichten rekening te houden met bijzondere potentiële gevaren tijdens de productie en het gebruik van genetisch gemodificeerde virussen. Onder de potentiële gevaren worden als bijzonder ernstig beschouwd :

- mogelijke incidentele productie van een voor de mens, dier of plant zeer pathogene recombinante stam,
- de oncontroleerbare vermeerdering van een artificiële virale stam, welke haar pathogeniciteit ook;
- het gebruik van geneeskundige of industriële preparaten van virale vectoren gecontamineerd door niet- geïdentificeerde en/of niet-gedetecteerde virale soorten.

Gebaseerd op het behoud of het verdwijnen van het vermogen van de vector zich eindeloos te vermeerderen door de uitgevoerde genetische modificatie, kunnen twee typen virale vectoren tegenover elkaar geplaatst worden.

De propagerende vectoren bestaan ofwel uit een preparaat genetisch gemodificeerde virale partikels competent voor replicatie, zoals vectoren afgeleid van poxvirussen, ofwel uit een mengsel genetisch gemodificeerde partikels deficiënt voor replicatie en « hulp »partikels competent voor replicatie, klassiek het wild type oudervirus. Deze laatste kunnen het gebrek aan replicatie van de vector in trans aanvullen. Dit is bijvoorbeeld het geval voor bepaalde vectoren afgeleid van het Herpesvirus (amplicons). De vereiste inperkingscondities voor de manipulatie van propagerende vectoren zijn ofwel strikter, ofwel gelijkwaardig aan diegene vereist voor de manipulatie van het wild type virus waarvan de propagerende vector is afgeleid en dit al naargelang de gedragen vreemde sequenties of inserten een gevaar vormen of niet.

De niet-propagerende vectoren bestaan uit een a priori zuiver preparaat van virale vectoren deficiënt voor replicatie. Binnen deze categorie vallen het merendeel van de vectoren afgeleid van het retrovirus MLV, de lentivirussen, het Adeno-Associated Virus (AAV) en de adenovirussen. Een vector die niet in staat is zich te vermeerderen blijkt a priori minder gevaarlijk te zijn dan een vector opgebouwd uit dezelfde virale stam maar in staat zich te vermeerderen. De inperkingscondities voor de vectoren deficiënt voor replicatie zijn gelijkwaardig of minder stringent dan deze voor het wild type virus waarvan ze afstammen tenzij de vreemde gedragen sequenties op zichzelf een gevaar vertonen. Ze hangen af van de inschatting van het risico dat deze vectoren incidenteel het vermogen verschaffen zich oncontroleerbaar te vermeerderen. Dit risico verschilt al naargelang men de fase van productie of de fase van het gebruik van de vector beschouwt. De productie beroept zich op transcomplementatie celsystemen die tijdelijk of constitutief de virale genen tot expressie brengen die nodig zijn voor de assemblage en/of de replicatie van de virale partikels. Tijdens die fase is het fenotype dat van een propagerende vector en zijn de risico's voor incidentele vermeerdering gelijkwaardig. De vereiste inperking tijdens die fase is dus dat van een propagerende vector afgeleid van dezelfde virale stam. Buiten de productiefase is er minder risico op verspreiding en kan de inperking minder strikt zijn. Niettemin bestaat er een blijvend risico gebonden aan het mogelijk incidenteel scheppen van transcomplementatiecondities. Tijdens de productiefase kan men een genetische recombinatie met de transcomplementatiesequenties of een contaminatie van het mengsel met wild type viruspartikels vrezen. Gedurende de fase van gebruik wordt de mogelijkheid op een transcomplementatie door een celproteïne, in staat zich in de plaats te stellen van een viraal proteïne, en de mogelijkheid op een infectie door het wild type oudervirus van cellen die de vector hebben opgenomen, in beschouwing genomen. De beoordeling van dit risico houdt rekening met de aard van het virus waarvan de vector afgeleid is, de opbouw van de vector, zijn productiemodaliteiten, het aantal geproduceerde vectorpartikels, het aantal getransduceerde doelwitcellen en van de aard van het gastheerorganisme.

Het deficiënte karakter van de niet- propagerende vectoren kan volgens het aantal virale genen waarvan de functie vernietigd werd door de genetische modificatie min of meer uitgesproken zijn. De kans op een incidentele reversie tot een fenotype competent voor replicatie vermindert met het aantal veranderde functies.

De vectoren die weinig of geen leesfase (« reading frame ») bevatten coderend voor virale proteïnen worden als de meest veilige beschouwd.

De classificatie van een activiteit die gebruik maakt van een virale vector kan van de aard van de virale vector, de aard van de gedragen sequenties en van het beschouwde typegebruik afgeleid worden. Hieronder staan richtsnoeren voor virale vectoren zoals adenovirale vectoren, vectoren afgeleid van retrovirussen, muriene leukemia virussen (MLV), vectoren afgeleid van lentivirussen, vectoren afgeleid van poxvirussen, vectoren afgeleid van afhankelijke (AAV) en autonome (MVM) parvovirussen. Voor de andere vectoren moet de indeling geval per geval bestudeerd worden.

Uitzonderingen op deze indelingsbeginselen zijn :
- de gedragen sequenties coderen voor een bijzonder gevaarlijk proteïne, zoals een toxine,
- de gedragen sequenties zijn in staat een hybride virus te genereren tussen pathogene virussen.

2. Specifieke gevallen

2.1. Deficiënte adenovirale vectoren afgeleid van menselijke adenovirussen van het serotype 2 of 5

De oudervirussen zijn pathogene organismen die behoren tot risicoklasse 2 voor de mens en waarvan het gebruik een inperkingsniveau 2 vereist. De productie en het gebruik van vectoren die ervan zijn afgeleid vereist ten minste een inperkingsniveau 2. De met adenovirale vectoren behandelde dieren mogen echter ondergebracht worden in proefdierenverblijven van inperkingsniveau 1 als het insert niet van die aard is dat het de kans op risico's versterkt en indien de afwezigheid van vectoren in de biologische vochten, afscheidingen en uitscheidingen werd aangetoond. Op dezelfde wijze zijn de patiënten in geval van klinische proeven bij de mens niet meer onderworpen aan een inperking nadat de afwezigheid van vectoren in de biologische vochten, afscheidingen en uitscheidingen werd aangetoond. Een inperkingsniveau 3 is vereist voor de productie van de virale vectoren die drager zijn van een insert dat de kans op risico's versterkt en voor alle andere gebruiken van grote hoeveelheden (grote volumes en/of hoge titers) geproduceerde virale suspensies (hanteren van de virale suspensies, celculturen behandeld met deze suspenties, dieren behandeld met deze suspensies).

2.2. Deficiënte vectoren afgeleid van het muriene leukemia virus (MLV)

Het oudervirus is een pathogeen organisme dat behoort tot risicoklasse 3 voor dieren en waarvan het gebruik een inperkingsniveau 2 vereist. De productie en het gebruik van ecotrope vectoren die ervan zijn afgeleid vereist maximaal een inperkingsniveau 2. De productie en het gebruik van amfotrope vectoren die ervan zijn afgeleid worden ten minste uitgevoerd in een inperkingsniveau 2. De productie en het gebruik in grote hoeveelheden van amfotrope virale vectoren die drager zijn van een insert dat de kans op risico versterkt vereist een inperkingsniveau 3.

De dieren behandeld met retrovirale vectoren mogen ondergebracht worden in proefdierenverblijven van inperkingsniveau 1 indien het insert niet van die aard is dat het de kans op risico's versterkt en indien de afwezigheid van de vector in de biologische vochten, afscheidingen en uitscheidingen werd aangetoond. Op dezelfde wijze zijn de patiënten in geval van klinische proeven bij de mens niet meer onderworpen aan een inperking nadat de afwezigheid van vectoren in de biologische vochten, afscheidingen en uitscheidingen werd aangetoond.

2.3. Deficiënte vectoren afgeleid van lentivirussen (HIV-1)

Het oudervirus is een pathogeen organisme behorend tot risicoklasse 3 voor de mens.

De productie en het gebruik van de vectoren die ervan zijn afgeleid moeten ten minste uitgevoerd worden in een inperkingsniveau 2. De productie en het gebruik in grote hoeveelheden van virale vectoren die drager zijn van een insert dat de kans op risico's kan versterken vereist een inperkingsniveau 3. Bovendien moet nauwlettend toegezien worden op de manier waarop deze vectoren zijn opgebouwd en in het bijzonder op niveau van de behouden lentivirale sequenties die niet absoluut nodig zijn voor de productie van de vectoren. De gevolgde protocols die de afwezigheid van replicatieve virussen in de bekomen preparaten moeten aantonen dienen aandachtig bekeken te worden.

2.4. Propagerende vectoren afgeleid van poxvirussen (vaccinia en canarypox ALVAC)

Vaccinia : het oudervirus vaccinia WT wordt ondergebracht in risicoklasse 2 voor mens en dier. Het gebruik ervan vereist een inperkingsniveau 2. De productie en het gebruik van recombinante virussen die ervan zijn afgeleid worden uitgevoerd in een inperkingsniveau 2.
De door deletie sterk verzwakte virale ouderstammen zoals bijvoorbeeld de stam NYVAC worden daarentegen ondergebracht in risicoklasse 1. Het gebruik van de recombinante vectoren die ervan zijn afgeleid kunnen uitgevoerd worden in een inperkingsniveau 1 indien het insert niet van die aard is dat het de kans op risico's versterkt.

Canarypox - ALVAC : de virale ouderstam ALVAC behoort tot risicoklasse 1, het gebruik ervan vereist een inperkingsniveau 1. De productie en het gebruik van de recombinante virussen die ervan zijn afgeleid vereist respectievelijk een inperkingsniveau 1 of 2, naargelang het insert al dan niet van die aard is dat het de kans op risico's versterkt.

2.5. Vectoren afgeleid van afhankelijke (AAV-2) en autonome (MVM en H-1) parvovirussen

AAV-2 :Het wild type AAV-2 is niet pathogeen en behoort tot risicoklasse 1. Het gebruik ervan vereist een inperkingsniveau 1. De niet-propagerende vectoren die ervan zijn afgeleid vereisen hetzelfde niveau van inperking. In het geval de kans op risico's echter versterkt wordt door de aard van het insert, zal het vereiste inperkingsniveau ten minste 2 bedragen. Indien de productie van AAV-vectoren het gebruik van het wild type adenovirus met zich meebrengt, vereist dit ten minste een inperkingsniveau 2.

MVH en H-1 : deze virussen behoren tot risicoklasse 1 voor de mens en 2 voor dieren. Hun manipulatie vereist een inperkingsniveau 2. De manipulatie van de vectoren die ervan zijn afgeleid vereist eveneens een inperkingsniveau 2. Een inperkingsniveau 1 kan niettemin aangenomen worden indien het gebruikte insert niet van die aard is dat het de kans op risico's versterkt en indien het systeem bestaande uit de vector en de gebruikte transcomplementaire cellen, noch in theorie noch experimenteel aangetoond, replicatie competente virussen (RCV) kan produceren.

B. Versterking van het risico dat afhangt van de aard van het insert

Er is een versterking van het risico wanneer het insert, dat in staat is tot expressie, voor, de synthese van een product dat gevaarlijk is voor de mens of het leefmilieu codeert. Er is eveneens een versterking van het risico, wanneer het insert het expressie-, integratie- en/of replicatievermogen van de vector vergroot.

De volgende DNA-sequenties vereisen een bijzondere risico-evaluatie, wanneer zij in de praktijk in staat zijn tot expressie (bijvoorbeeld klonering in een virale expressievector) :

- de genen waarvan het expressieproduct tussenkomt in de mechanismen van cellulaire voortplanting, van cellulaire immortalisatie en apoptose. Deze definitie omvat ondermeer de proto-oncogenen en oncogenen;
- de menselijke genen of hun equivalent bij de hogere zoogdieren, waarvan het expressieproduct een belangrijke fysiologische functie kan uitoefenen (bijvoorbeeld groeifactoren, interleukine, neurotransmitters, enz.);
- de DNA-sequenties of de genen die verantwoordelijk zijn voor de overdracht van virale, bacteriële, fungoïde, parasitaire determinanten met gastheerspecificiteit;
- de genen die coderen voor - of tussenkomen in de regulatie van - de productie van een toxine;
- de DNA-sequenties afkomstig van organismen van pathogeniteitsklasse 3 en 4;
- elke DNA-sequentie waarvan de rol onbekend is.

C. Celculturen

In dit besluit worden enkel de genetisch gemodificeerde celculturen of celculturen drager van pathogene agentia bedoeld.

Onder de risico's gekoppeld aan manipulatie van celculturen kunnen enerzijds de risico's verbonden met intrinsieke eigenschappen van de celculturen, inclusief de aard van mogelijke genetische modificaties, en anderzijds de risico's verbonden aan de incidentele besmetting of doelbewuste infectie door pathogene of genetisch gemodificeerde agentia (bijvoorbeeld wild type of recombinante virussen) onderscheiden worden.

Het risico gekoppeld aan de genetische modificatie ligt ofwel bij de karakteristieken van het tot expressie gebrachte recombinant product zelf (bijvoorbeeld recombinante proteïnen), ofwel bij de kans op integratie, replicatie en expressie van het vreemde genetische materiaal (bijvoorbeeld de kans op integratie, replicatie en expressie van het vreemde genetische materiaal gedragen door recombinante virussen in de cellen van de experimentator). Dit moet geval per geval geëvalueerd worden.

1. Primaire celculturen

De risico's eigen aan het ingeperkt gebruik van primaire culturen zijn voornamelijk verbonden met het type van de bemonsterde cellen (normaal of tumoraal weefsel), aan hun oorsprong (aanwezigheid van potentiële infectieuze agentia), aan de monstername-condities en de manipulatie van de explantaten bestemd voor cultuur, aan de aard van de genetische modificatie en aan het type gepland gebruik. Het na te streven niveau van inperking wordt dus bepaald in functie van deze factoren.

a) het ingeperkt gebruik van primaire culturen die niet afkomstig zijn van de mens of van primaten en die vrij zijn van pathogene organismen (bijvoorbeeld cellen afkomstig van SPF- of "Specific Pathogen Free" dieren en waarvan de staalname- en manipulatiecondities er voor zorgen eventuele contaminaties door pathogene organismen te vermijden, of waarvan de kwaliteitscontrole afwezigheid van contaminatie aantoonde), mogen a priori beschouwd worden als behorend tot risicoklasse 1. De risicoklasse van het ingeperkt gebruik zal ook afhangen van het ingebrachte genetisch materiaal. In het geval het ingebrachte genetisch materiaal de kans op risico's niet versterkt, kunnen deze culturen gemanipuleerd worden in een inperkingsniveau 1, op voorwaarde de goede microbiologische praktijken te respecteren ten einde hun accidentele contaminatie door pathogene organismen te vermijden, en desnoods een regelmatige kwaliteitscontrole van de cellen uit te voeren om die afwezigheid van contaminatie te controleren.

b) het ingeperkt gebruik van primaire celculturen die afkomstig zijn van de mens of van primaten behoren ten minste tot risicoklasse 2 ten gevolge van de kans op de versterking van risico's door de mogelijke aanwezigheid van pathogene organismen (vooral de culturen verwezenlijkt op basis van bloed, lymfocyten, zenuwweefsel of tumoraal weefsel worden beschouwd als hoog risico materiaal). Ze vereisen ten minste een inperkingsniveau 2 of meer en dit afhankelijk van de mogelijke risicoklasse van het of de pathogene contaminerende organismen, alsook het ingebrachte genetisch materiaal. Ze vereisen ook het gebruik van een microbiologische veiligheidskast van klasse II. In geen enkel geval kunnen deze culturen worden gemanipuleerd in een veiligheidskast met een horizontale laminaire flux.

c) de risicoklasse van ingeperkt gebruik van primaire celculturen die drager zijn van pathogene organismen of van primaire celculturen die doelbewust geïnfecteerd zijn met pathogene organismen zal afhangen van de biologische risicoklasse van het betrokken pathogene organisme. Dit ingeperkt gebruik vereist ten minste de inperking voor het betrokken pathogene organisme of meer en dit afhankelijk van het ingebrachte genetisch materiaal, alsook het gebruik van een microbiologische veiligheidskast van klasse II. In geen enkel geval kunnen deze culturen worden gemanipuleerd in een veiligheidskast met een horizontale laminaire flux.

2. Cultuur van cellijnen

De risico's eigen aan het ingeperkt gebruik van culturen van cellijnen omvatten de risico's van de primaire culturen waarvan ze afgeleid zijn evenals de risico's verbonden met de wijze van immortalisatie (bijvoorbeeld, virale transformatie of gebruik van gekloneerde oncogenen) en de risico's verbonden met het geplande typegebruik.

a) het ingeperkt gebruik van cellijnen die niet afkomstig zijn van de mens of van primaten kunnen a priori beschouwd worden als behorend tot risicoklasse 1. De risicoklasse van het ingeperkt gebruik zal ook afhangen van het ingebrachte genetisch materiaal. Voor zover het ingebrachte genetisch materiaal geen kans op een versterking van de risico's met zich meebrengt, kunnen deze cellijnen gemanipuleerd worden in een inperkingsniveau 1, op voorwaarde de goede microbiologische praktijken te respecteren ten einde hun accidentele contaminatie door pathogene organismen te vermijden, en desnoods een regelmatige kwaliteitscontrole van de cellen uit te voeren om die afwezigheid van contaminatie te controleren.

b) het ingeperkt gebruik van cellijnen die afkomstig zijn van de mens of van primaten voor zover deze goed gekarakteriseerd en gewaarmerkt zijn, vrij van endogene virussen en zonder zichtbare risico's voor de gezondheid en het milieu zijn, kunnen a priori beschouwd worden als behorend tot risicoklasse 1. De risicoklasse van het ingeperkt gebruik zal tevens afhangen van het ingebrachte genetisch materiaal. Voor zover het ingebrachte genetisch materiaal de kans op risico's niet zal versterken, mogen deze cellijnen gemanipuleerd worden in een inperkingsniveau 1, op voorwaarde de goede microbiologische praktijken te respecteren ten einde hun incidentele contaminatie door pathogene organismen te vermijden, en desnoods een regelmatige kwaliteitscontrole van de cellen uit te voeren om die afwezigheid van contaminatie te controleren. Het gebruik van een microbiologische veiligheidskast van klasse II is niettemin vereist. In geen enkel geval kunnen deze culturen worden gemanipuleerd in een veiligheidskast met een horizontale laminaire flux.

c) het ingeperkt gebruik van niet volledig gekarakteriseerde en gewaarmerkte cellijnen afkomstig van de mens of van primaten, met uitzondering van diegene die in staat zijn endogene pathogene organismen te bevatten zoals virussen die bloed contamineren, behoren ten minste tot risicoklasse 2, ten gevolge van de kans op een versterking van de risico's verbonden met de mogelijke aanwezigheid van nog niet geïdentificeerde pathogene organismen. De risicoklasse zal tevens afhangen van het ingebrachte genetisch materiaal. Deze cellijnen vereisen ten minste een inperkingsniveau 2 of meer en dit in functie van het ingebrachte genetisch materiaal, evenals het gebruik van een microbiologische veiligheidskast van klasse II. In geen enkel geval kunnen deze culturen worden gehanteerd in een veiligheidskast met een horizontale laminaire flux.

d) de risicoklasse van het ingeperkt gebruik van cellijnen drager van pathogene organismen of van cellijnen doelbewust geïnfecteerd met pathogene organismen, zal afhangen van de biologische risicoklasse van het betrokken pathogeen organisme. Dit ingeperkt gebruik vereist ten minste de inperking voor het betrokken pathogeen organisme of meer en dit in functie van het ingebrachte genetisch materiaal, evenals het gebruik van een microbiologische veiligheidskast van klasse II. In geen enkel geval kunnen deze culturen worden gemanipuleerd in een veiligheidskast met een horizontale laminaire flux.

[Home Page] [Vorig Menu] [Zoek] Copyright ©2005 WIV-SBB  Contact  Privacy